王月兰 龙迪和 李晓民 汪克明 吴子建 蔡荣林 何璐 周逸平

（安徽中医学院针灸经络研究所，针灸基础与技术安徽省重点实验室培育基地，安徽合肥 230038）

摘  要：目的：研究 UII在针刺抗心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法：选择心肌缺血再灌注模型SD大鼠120只，随机分为6组，正常对照组（N）、模型组（M）、针刺预处理组（C）、针刺+尾加压素低浓度组（20pmol/kg）(AL)、针刺+尾加压素高浓度组（60pmol/kg）(AH)和血管紧张素II特异性受体拮抗剂组(UR) (Losartan氯沙坦 40mg/kg),每组20只。针刺预处理组连续3天电针预处理，第三天复制心肌缺血再灌注模型。AL、AH组造模前尾静脉给药，给药后即刻造模。UR组于造模前进行灌胃给药，给药后即刻造模。造模成功后常规饲养24小时，处死取材，用ELISA方法测量心肌组织液中的Rat UⅡ、GPR14。结果：心肌缺血再灌注损伤时模型大鼠心肌组织中UII含量显著降低(P<0.01)，同时GPR14含量升高，针刺预处理、针刺结合不同浓度UII以及使用血管紧张素II特异性受体拮抗剂均可以使缺血区心肌组织中的UII含量显著升高，同时GPR14含量降低，以针刺结合低浓度UII组效果最优（P<0.01）。结论： UII可能是抗急性心肌缺血再灌注损伤的重要途径之一。

关键词：针刺 心肌缺血 再灌注损伤 尾加压素II  GPR14

尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ,UⅡ)是人体内目前已知的最强的缩血管物质,主要分布于心血管中，中枢神经系统和肾、肺、肠系膜也有少量分布。UII作为机体内强有力的缩血管物质，与心肌细胞收缩功能密切相关，并呈现剂量依赖性,但其对心血管疾病的发生、发展及其在治疗中的作用目前了解仍甚少。UII受体是一种孤立的G蛋白偶联受GPR14(G-Protein coupled recepter)，亦主要分布于心血管和神经系统^[1-3]。UⅡ与GPR14结合后,可以引起细胞内Ca²⁺浓度增加，有增强细胞的功能作用。

针刺对心肌缺血不仅具有良好的治疗作用，而且有很好的预防作用。以往的研究证实了电针心经“神门”可以有效改善急性心肌缺血大鼠心功能，保护心肌细胞，抑制细胞凋亡的发生^[4-5]。本研究结合中医针灸理论与现代生物医学技术，针对针刺预处理（Acupuncture Pre-condition, APC）和U II及其信号转导的机制进行设计，深入探讨U II在APC中作用机理，初步探索针刺预处理和尾加压素预处理在心肌缺血再灌注损伤中的作用，为阐明经脉脏腑相关实质提供科学的实验依据和基础。

1 材料和方法

1.1  动物 

取同等条件下饲养健康SD大鼠120只，雌雄各半，体质量200±20g, (安徽全椒实验动物有限公司提供，合格证号：(06)量认（苏）字(Z0582)号)

1.2  试剂

UROTENSIN-II（SIGMA-ALDRICH,INC。LOT: 054K4788）；Ang II检测试剂盒（上海西塘生物科技有限公司  批号：0705468）；SB-710411（SIGMA-ALDRICH,INC  lot:420402）；CK检测试剂盒（南京建成生物工程研究所 批号：5348962）；LDH检测试剂盒（南京建成生物工程研究所 批号：5340216）；UII（UNIONHONEST#ADL，批号：110D2356）；GPR14（UNIONHONEST#ADL，批号：1102F547）；血管紧张素II特异性受体拮抗剂（Losartan氯沙坦）。

1.3  仪器

BIOPAC十六导生理纪录仪（美国加州产，MP100A-CE）；全自动生化分析仪（丹麦DAKO公司）；PCE－A型程控电针治疗仪（安徽天恒科技实业有限公司）；BL-220H型电子天平（SHIMADZU CORPORATCON JAPAN）；DY89-II型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技有限公司）；TGL-16 高速离心机（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；台式离心机（80-2，江苏省金坛市宏凯仪器厂）。

1.4 实验条件　

动物于安静的环境下分笼饲养，室温控制在22±1℃（空调）的范围内，相对湿度60%左右，自然光照，塑料笼内以消毒木屑为垫料，食水自取。

1.5 实验动物分组

SD大鼠120只随机分为6组（按照《卫生统计学》随机数字表^[6]），分别为正常组（N）、I/R模型组（M）、针刺预处理组（C）、针刺+尾加压素低浓度组（AL）（20pmol/kg）、针刺+尾加压素高浓度组（AH）（60pmol/kg）、血管紧张素II特异性受体拮抗剂组（UR），每组20只。

1.6 急性心肌缺血再灌注动物模型复制和评定

模型复制前先记录正常标Ⅱ导联心电图，心电图异常者淘汰不用。大鼠用乙醚麻醉后，固定于鼠台上，沿胸骨左缘剪开皮肤，用止血钳游离大鼠左侧的胸大肌，暴露左第2、3、4肋，可以清晰的看到心脏的暗影，用弯头止血钳迅速沿胸骨左缘3、4肋间分开肋骨，挤出心脏，充分暴露心脏及其表面的血管，用4/0医用缝合线在冠状动脉前降支挂线，然后迅速将心脏送回胸腔，医用缝合线的两端留置体外备用。用长嘴止血钳把胸部皮肤和肌肉以及心脏挂线夹紧，防止气胸，观察心电图变化，T波高耸或者倒置为心肌缺血标志，如心电图改变不明显，则稍稍松一点止血钳，拉紧一端线头，这时则可以明显的看到心电图改变，30分钟后，再灌注时，则松开止血钳，把挂线放松，形成再灌注损伤模型。从开胸到关闭胸腔，控制在1min以内完成。

心肌缺血和再灌注模型成功指标：心电图表现为ST段抬高和（或）T波高耸或者倒置。再灌注损伤模型成功标志，再灌注后，抬高的 ST 段下降 50% 以上或高耸的T波下降。见图 （1-3）

图1  正常大鼠标II导联心电图

Fig 1 Standard ECG of II-lead in normal rats

图2  即刻阻断大鼠心脏冠状动脉标II导联心电图

Fig 2 ECG of II-lead in obstacle coronary artery spontenously

图3  心肌缺血30分钟再灌注后标II导联心电图

Fig 3 ECG after reperfusion with myocardial ischemia 30 min

1.7           穴位选择

根据以往的实验方法，选取“神门”、“内关”^[7]，酒精消毒所取穴位，采用0.5寸毫针，直刺3mm，连接PCE-A电针仪，选择刺激电压5V，电流强度1.1mA，2Hz，波宽300μm，正负向交替方波刺激，以针体微微抖动为度，每次30min，1次/天，电针3天。

1.8           标本采集

模型复制成功后24小时，10％水合氯醛（0.36ml/100g体质量）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉真空管采血，离心，选取上层血浆。即刻标记放入液氮冷藏保存；同时取大鼠左心室心尖部缺血区心肌组织，称重，按照1：9的比例加入生理盐水，匀浆，离心，选取上清液，制成10%的组织溶液，标记放入液氮冷藏保存待测。

1.9  统计处理

实验数据采用均数±标准差（ ±S）表示，各组间均数比较采用单因素方差分析（One-way  ANOVA），组间均数的两两比较采用q检验(Newman-Keuls  test)法，P<0.05有统计学意义。数据的处理采用SPSS  for  windows13.0软件分析。

2．结果

结果表明模型组大鼠缺血区心肌组织UⅡ含量显著降低(P<0.01)，同时GPR14的含量升高。C、AL、AH和UR组均能使心肌缺血再灌注损伤模型心肌组织缺血区的UⅡ含量显著升高，同时GPR14的含量降低。AL组中的心肌组织中的UII含量和GPR 14的含量均高于C、AH、UR组，AL组和UR组之间组间比较没有明显差异。具体见表1、2。

表1   针刺抗I/R模型大鼠缺血区心肌组织UII含量的影响（ ）

Tab 1  The effect of UII on UII in ischemia myocardium of acu I/R rats

组别	UII（pg/ml）
正常组（N）	78.97±3.81
模型组（M）	16.23±1.21**▲▲ ##ΔΔ
针刺组（C）	38.20±2.09**★##ΔΔ&
UII低组（AL）	43.82±1.30**★★▲#ΔΔ
UII高组（AH）	36.58±3.42**★★▲▲Δ&
氯沙坦组（UR）	42.77±1.99**★★▲▲##

^*P <0.05vs N组 ，^** P <0.01vs N组；^★ P<0.05vs M组；^★★P<0.01vs M组；^▲P <0.05 vs C组，^▲▲P <0.01 vs C组；^& P <0.05vs AL组 ，^&& P <0.01vs AL组；^# P <0.05vs AH组, ^## P <0.05vs AH组;^ΔP <0.05vs UR组, ^ΔΔ P <0.01vs UR组

Fig 4 The effect of UII on UII in ischemia myocardium of acu I/R rats

图 4  针刺抗I/R模型大鼠缺血区心肌组织UII含量的影响

表2  针刺抗I/R模型大鼠缺血区心肌组织GPR14含量的影响

Tab 1  The effect of UII on GPR14 in ischemia myocardium of acu I/R rats

组别	GRP 14(pg/ml)
正常组（N）	107.70±15.56
模型组（M）	234.93±21.21**▲▲##ΔΔ
针刺组（C）	161.57±11.51**★★##ΔΔ
UII低组（AL）	124.12±10.82**★★▲#ΔΔ
UII高组（AH）	144.76±6.18**★★▲▲Δ
氯沙坦组（UR）	129.45±10.30**★★▲▲##

^*P <0.05vs N组 ，^** P <0.01vs N组；^★ P<0.05vs M